Un interrupteur génétique contrôle la colonisation de surface par Pseudomonas aeruginosa | Weifang BrightMountain Ventures Co., Ltd.

Nature Microbiology (2023)Citer cet article

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Une colonisation efficace des surfaces muqueuses est essentielle pour les agents pathogènes opportunistes tels que Pseudomonas aeruginosa, mais la façon dont les bactéries s'adaptent collectivement et individuellement pour optimiser l'adhérence, la virulence et la dispersion est largement incertaine. Ici, nous avons identifié un commutateur génétique stochastique, hecR – hecE, qui est exprimé de manière bimodale et génère des sous-populations bactériennes fonctionnellement distinctes pour équilibrer la croissance et la dispersion de P. aeruginosa sur les surfaces. HecE inhibe la phosphodiestérase BifA et stimule la diguanylate cyclase WspR pour augmenter les niveaux de second messager c-di-GMP et favoriser la colonisation de surface dans une sous-population de cellules ; les cellules exprimant HecE à bas niveau se dispersent. La fraction de cellules HecE + est réglée par différents facteurs de stress et détermine l'équilibre entre la formation de biofilm et la dispersion cellulaire à longue distance des communautés cultivées en surface. Nous démontrons également que la voie HecE représente une cible médicamenteuse pour contrer efficacement la colonisation de surface par P. aeruginosa. L'exposition de tels états binaires ouvre de nouvelles voies pour contrôler les infections des muqueuses par un agent pathogène humain majeur.

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Les ensembles de données générés et/ou analysés au cours de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Les fichiers de séquençage bruts de l'expérience d'immunoprécipitation de la chromatine avec séquençage sont accessibles au NCBI sous le numéro d'accession PRJNA900431. Des matériaux biologiques uniques sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Les coordonnées structurales du dimère BifA R-state sont déposées dans la bibliothèque PDB sous le numéro d'accession 8ARV.

Le code généré pour l'analyse des données de cytométrie en flux est accessible à l'adresse https://github.com/Jenal-Lab.

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Nous remercions F. Hamburger (Biozentrum, Université de Bâle) pour son aide au clonage. Nous remercions E. Maffei et A. Harms (Biozentrum, Université de Bâle) pour leur soutien à l'isolement et à la caractérisation des phages. Ce travail a été soutenu par une bourse de doctorat Biozentrum au CM, le Fonds national suisse de la recherche scientifique (subvention n ° 310030_189253 à UJ), le PRN AntiResist financé par le Fonds national suisse de la recherche scientifique (subvention n ° 51NF40_180541 à KD et UJ), le Conseil européen de la recherche (subvention n° 716734 à KD) et subventions de Sygeforsikring Danmark, Danish Innovation Fund et Novoseed à MG et TT-N.

Tina Jäger

Adresse actuelle : Département Biomedizin, Université de Bâle, Bâle, Suisse

Jacob G.Malone

Adresse actuelle : Department of Molecular Microbiology, John Innes Centre, Norwich, Royaume-Uni

Biozentrum, Université de Bâle, Bâle, Suisse

Christina Manner, Raphael Dias Teixeira, Dibya Saha, Andreas Kaczmarczyk, Raphaela Zemp, Fabian Wyss, Tina Jaeger, Benoit-Joseph Laventie, Jacob G. Malone, Sebastian Hiller, Knut Drescher et Urs Jenal

sciCORE, Centre de calcul scientifique, Université de Bâle, Bâle, Suisse

Sébastien Boyer

Département de chimie, Université technique du Danemark, Lyngby, Danemark

Katrine Qvortrup

Costerton Biofilm Center, Université de Copenhague, Copenhague, Danemark

Jens Bo Andersen, Michael Givskov et Tim Tolker-Nielsen

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Conceptualisation : CM, TJ et UJ Méthodologie : CM, RDT, DS, AK, RZ, TJ, B.-JL, JGM, JBA, MD, TT-N., KQ, KD et UJ Analyse formelle : CM, RDT, SB et DS Investigation : CM, RDT, DS, RZ, TJ, JGM, FW et JBA Rédaction (version originale) : CM et UJ Financement acquisition : MG, TT-N., KD, KQ, SH et UJ Supervision : SH, KD et UJ

Correspondance à Urs Jenal.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Microbiology remercie Tim Rick, Daniel Wozniak et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, Morphologie de la colonie du mutant hecR::Tn. b, Morphologie des colonies des souches de délétion WT et hec. Les expériences ont été réalisées en triple ; une image représentative est affichée. c, Croissance des souches de suppression de P. aeruginosa WT et hec avec des valeurs moyennes et le sd de trois répétitions biologiques (avec six répétitions techniques chacune). d, Croissance de souches de délétion WT et hec contenant des plasmides pour l'expression de gènes hec à partir d'un promoteur inductible par IPTG (EV, plasmide contrôle). La croissance dans LB (lignes pointillées) ou LB complétée par 100 µM d'IPTG (lignes pleines) a été enregistrée, et les valeurs moyennes et le sd de trois répétitions biologiques (avec trois répétitions techniques chacune) sont indiqués. e, Morphologie des colonies de P. aeruginosa WT et mutants dépourvus d'exopolysaccharides Pel ou Psl exprimant hecE à partir d'un promoteur inductible par IPTG. Les expériences ont été faites en triple ; une image représentative est affichée.

a, Schéma de l'architecture du domaine BifA et du fragment BifA identifié par Y2H pour interagir spécifiquement avec HecE (TM, domaine transmembranaire ; SID, plus petit domaine d'interaction). b, Structure tridimensionnelle d'un dimère BifA intégré dans la membrane cytoplasmique (gris) comme prédit par AlphaFold. c, analyse CoIP-MS de HecE. Des expériences d'immunoprécipitation ont été réalisées en utilisant la souche PAO1 WT ou une souche exprimant HecE marqué FLAG C-terminal et des billes magnétiques conjuguées anti-M2. Les protéines retenues sur les billes ont été analysées par spectrométrie de masse. Les données obtenues à partir de trois répétitions biologiques sont présentées sous forme de parcelles de volcan. Les rapports d'intensité transformés en log2 des peptides détectés entre HecE – Flag et le WT (ctrl) ont été calculés et tracés par rapport aux valeurs dérivées de l'analyse de signification (statistique t modifiée, méthode empirique de Bayes59). d, morphologie des colonies de souches sauvages et mutantes de P. aeruginosa contenant un plasmide vide (EV) ou un plasmide exprimant hecE à partir d'un promoteur inductible par l'IPTG. Les expériences ont été faites en triple ; une image représentative est affichée. e, Croissance (en haut) et fluorescence (niveaux de c-di-GMP, en bas) des souches P. aeruginosa de type sauvage (WT), hecR :: Tn et ΔbifA portant un plasmide contrôle (EV) ou un plasmide exprimant le c- capteur di-GMP cdGreen. Les valeurs moyennes et le sd de deux répétitions biologiques (avec six répétitions techniques chacune) sont présentés.

a, L'expression de hecR augmente les niveaux de HecR et HecE. Analyse par immunoblot de HecR et HecE dans des souches exprimant des copies chromosomiques marquées par le drapeau de hecR ou hecE. Les souches contenaient un plasmide exprimant hecR, hecE ou les deux gènes à partir d'un promoteur inductible par l'arabinose (EV, plasmide témoin). Des extraits de cellules cultivées en présence (+) ou en absence (-) de l'inducteur arabinose ont été analysés par immunotransfert avec un anti-Flag (n = 1). b, HecR se lie à la région promotrice hecRE. Les tests EMSA ont été effectués avec de l'ADN marqué contenant la région promotrice hecRE et avec des concentrations croissantes de protéine HecR purifiée, comme indiqué (n = 2). c, HecR se lie exclusivement au locus hecRE sur le chromosome P. aeruginosa. Des expériences de pull-down de chromatine ont été réalisées avec une souche exprimant une copie de hecR marquée par HA en l'absence de la copie de hecR de type sauvage chromosomique et avec des anticorps spécifiques de HA. Les lectures de séquençage sont tracées sur l'axe y pour l'ensemble du chromosome P. aeruginosa (en haut) ou le locus hecRE (en bas). Les graphiques ont été générés à l'aide de la version Geneious 2019.0 créée par Biomatters. d, La fraction de cellules exprimant hecE change au cours de la croissance de P. aeruginosa. La densité optique (lignes pleines) et la fluorescence (expression de hecE ; lignes pointillées) ont été enregistrées lors de la croissance de souches rapporteurs hecRE-2mR contenant un plasmide exprimant hecR, hecE ou les deux gènes à partir d'un promoteur inductible par IPTG (EV, plasmide contrôle). Les valeurs moyennes et l'écart-type sont indiqués pour trois répétitions biologiques avec trois répétitions techniques chacune. e, La fraction de cellules exprimant hecRE est indépendante du milieu de culture. P. aeruginosa de type sauvage portant le rapporteur chromosomique hecRE-2mR a été cultivé dans le milieu indiqué pendant 20 h. La quantification des données de cytométrie en flux est indiquée pour trois répétitions biologiques. Les triplicats ont été ajustés indépendamment. La moyenne et la plage des valeurs calculées sont indiquées. La normalité des moyennes a été vérifiée à l'aide d'un test de Shapiro-Wilk (P < 0,05). Un test ANOVA unidirectionnel a été utilisé pour analyser les différences dans les moyennes de population (avec P < 0,05), suivi du test post-hoc HSD de Tukey, pour lequel les valeurs P ajustées sont indiquées. f, La fraction de cellules exprimant hecRE varie au cours de la croissance de P. aeruginosa. Les souches rapporteurs hecRE-2mR portant un plasmide exprimant hecR à partir d'un promoteur inductible par l'IPTG ont été diluées dans du LB frais et cultivées pendant 12 h (EV, plasmide témoin). Les intensités de fluorescence du rapporteur, mesurées par cytométrie en flux, sont représentées sous forme de courbes de violon (axe y gauche) et la croissance est indiquée en lignes pointillées (axe y droit). Les cellules avec des valeurs de signal supérieures au seuil indiqué (ligne grise) ont été comptées comme des cellules exprimant hecRE-2mR. g, L'expression de hecRE répond aux limitations nutritionnelles. La souche rapporteuse P. aeruginosa hecRE-2mR a été cultivée dans un milieu minimal MOPS avec différentes quantités de succinate comme seule source de carbone. La croissance et la fraction de cellules exprimant hecRE sont indiquées comme sur la figure 3f. h,i, Données de cytométrie en flux du rapporteur hecRE-2mR dans les mutants ΔrsmA (h) et ΔrpoS (i), cultivés dans MOPS avec les quantités indiquées de succinate à 37 °C. Les cellules avec une intensité de fluorescence plus élevée que la souche de type sauvage PAO1 ont été quantifiées (axe de droite). La densité optique de la culture avant cytométrie en flux est indiquée en pointillés (axe de gauche). j, L'expression ectopique de hecR induit la transcription de hecE uniquement en phase stationnaire. Analyse par cytométrie en flux des souches avec le rapporteur hecRE-2mR dans le type sauvage (WT) et les mutants indiqués. Des souches rapporteuses contenant un plasmide exprimant hecR ont été cultivées dans du LB additionné d'IPTG 100 µM soit en phase exponentielle, soit pendant 20 h (stationnaire). Des expériences de cytométrie en flux sont présentées pour trois répétitions biologiques avec les histogrammes individuels empilés dans le graphique. k, La fraction de cellules exprimant hecRE est augmentée à température élevée. La souche reporter P. aeruginosa hecRE-2mR hébergeant un plasmide exprimant hecR à partir d'un promoteur inductible par l'IPTG a été cultivée dans MOPS + succinate 20 mM additionné d'IPTG 100 µM à des températures croissantes, comme indiqué (EV, plasmide témoin). Des expériences de cytométrie en flux sont présentées pour trois répétitions biologiques avec les histogrammes individuels empilés dans le graphique. l, scan non recadré de l'immunoblot illustré en a. m, Stratégie de déclenchement utilisée pour les expériences de cytométrie en flux. Montré est l'un des trois réplicats du type sauvage portant le rapporteur hecRE-2mR.

a,d, Augmentation du volume du biofilm des souches sauvages et mutantes de P. aeruginosa. Les biofilms ont été segmentés en cubes d'une longueur de côté de 2,34 µm à l'aide de BiofilmQ70 et les volumes de biofilm ont été calculés comme la somme de tous les cubes individuels à un moment donné. La ligne rouge indique le début de l'événement de dispersion. L'analyse pour une expérience est montrée dans chaque panneau. b, e, les paramètres de l'objet, y compris la distance à la limite du biofilm (résolution, 20 voxels), les intensités de fluorescence et la densité cellulaire locale ont été calculés à l'aide de BiofilmQ. c, f, Les intensités fluorescentes au début de l'événement de dispersion (ligne rouge) ont été tracées et codées par couleur en fonction de leur distance à la limite du biofilm.

a, écart type de la moyenne des données d'attachement illustrées à la Fig. 5a. b, Fixation à base de plaques de microtitration de WT et de souches mutantes portant un plasmide exprimant la dgcZ diguanylate cyclase d' E. coli à partir d'un promoteur inductible par IPTG et divers allèles bifA à partir d'un promoteur inductible par le cumate (EV, plasmide contrôle). L'expression de BifA n'a pas été induite, l'expression de dgcZ a été induite avec 100 µM d'IPTG. H6-335-P1 a été ajouté aux concentrations indiquées. L'attachement a été quantifié après 9,5 h. Les valeurs moyennes de deux répétitions biologiques sont présentées. c, Arrangement de α6 et α5′ du dimère PdeL dans les états R- (PDB : 4LYK) et T (PDB : 4LJ3). Les résidus du site actif et les résidus impliqués dans la stabilisation de la conformation de l'état T sont mis en évidence et représentés sous forme de bâton. d, Arrangement de α6 et α5 'du dimère BifA dans l'état R- (PDB: 8ARV) et T modélisé. Les résidus du site actif et les résidus conservés postulés pour stabiliser la conformation de l'état T sont mis en évidence et représentés sous forme de bâton. e, f, écart type de la moyenne des données d'attachement illustrées à la Fig. 5d, e, respectivement.

Écran VCS

Écran hybride levure-deux

Écran suppresseur SCV

Collecte de données structurées et statistiques de raffinement

Les cellules de P. aeruginosa exprimant hecE restent attachées après la dispersion du biofilm.

La dispersion cellulaire à partir de biofilms cultivés en chambre d'écoulement est un processus hautement coordonné.

Les mutants dépourvus de HecE ne parviennent pas à maintenir un biofilm mature après la dispersion cellulaire.

Les mutants dépourvus de BifA subissent une formation prématurée de biofilm et une dispersion cellulaire.

Les mutants dépourvus de WspR ne parviennent pas à maintenir un biofilm mature après la dispersion cellulaire.

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Réimpressions et autorisations

Manner, C., Dias Teixeira, R., Saha, D. et al. Un interrupteur génétique contrôle la colonisation de surface par Pseudomonas aeruginosa. Nat Microbiol (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01403-0

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Reçu : 19 octobre 2022

Accepté : 05 mai 2023

Publié: 08 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41564-023-01403-0

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